细胞冻存液作为冻存细胞时的液体情况,给细胞提供着营养和�；ぷ饔�,可使冰点降低,提高细胞膜对水的通透性,能使细胞内水分在冻结前透出细胞,避免或减少冰晶对细胞的损伤,使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性生存起来,在需要时直接苏醒就可恢复细胞活性 。古板的细胞冻存液是使用培养基、血清和DMSO凭据一定的比例混淆,因其中的血清身分庞大、批次差别大等缺点,其应用具有局限性,且需要接纳程序性降温的冻存要领,费时辛苦 。
无血清非程序细胞冻存液(无酚红)化学身明白确,含有糖类、氨基酸等营养物质以及DMSO等多种�；ぜ�,大大降低了在冻存历程中冰晶关于细胞的损伤,有效提高细胞苏醒率和活力;不含血清身分,减少了外源因子和污染源,越发宁静、稳定;同时省去繁琐费时的程序性降温历程,可直接重悬细胞后置于-80℃生存,越日转移到液氮中 。
无血清非程序细胞冻存液 (无酚红) 高效、宁静、稳定、操作便捷,与古板细胞冻存液相比具有明显优势(表1),推荐用于通例哺乳动物细胞(包括肿瘤或转化细胞系、原代细胞、干细胞、免疫细胞等)的冻存,尤其适合无血清培养的细胞冻存 。因本产品不含酚红,所以也适用于激素相关实验细胞的冻存 。凭据一般情况冻存1管细胞使用1mL冻存液盘算,本产品可以用于约莫100管细胞的冻存 。
?表1：古板细胞冻存液和南宫28无血清非程序细胞冻存液(无酚红)的特点比较
?使用要领
??(一) 细胞冻存：
【冻存前,请确保细胞处于对数生恒久】
1.贴壁细胞制备细胞悬液：(悬浮细胞请忽略此办法)
(1) 将旧培养基吸除,用PBS清洗两遍 。
(2) 在培养瓶中加入少许胰酶,以能覆满瓶底为限 。将培养瓶平置于培养箱中消化约1~2分钟,期间在显微镜下视察,一旦发明细胞间隙增大、细胞变圆、比较松动后,立即终止消化(个体难消化细胞需要延长消化时间,但要制止消化太过) 。
(3) 加入适量温浴好的完全培养基终止消化,轻轻奏乐均匀细胞 。
2.贴壁细胞和悬浮细胞的冻存：
(1) 取少量细胞悬液细胞计数,算出细胞总数和所需细胞冻存液的量 。细胞的冻存密度以1×10^6~2×10^7 cells/ mL为宜 。
(2) 将所需量的细胞悬液转移至适当离心管中,200~500×g,离心3-5分钟, 弃上清收集细胞 。(离心速度和时间取决于细胞类型)
(3) 向细胞沉淀中加入适量无血清非程序细胞冻存液,用移液器轻轻奏乐以重悬细胞,分装于无菌细胞冻存管中,严密封口后,注明细胞名称、代数、日期 。
(4) 直接置于-80℃冰箱中贮存,细胞可至少生存一年;或者-80℃留宿后,越日将细胞投入液氮中恒久贮存 。
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(二) 细胞苏醒：
1. 自液氮罐或-80℃冰箱中取出冻存管,检查盖子是否旋紧,立即放入37℃水浴中快速解冻 。(制止冰晶重新结晶而造成细胞死亡),轻摇冻存管使其在1~2分钟内全部融化,以75%酒精擦拭冻存管外部,移入无菌操作台内 。
2. 将解冻的细胞悬液移至15mL无菌离心管中,再加入5~10mL预热好的完全培养基,轻轻混淆均匀,200~500×g,离心3-5分钟,弃上清收集细胞 。(离心速度和时间取决于细胞类型)
3. 加入预热好的完全培养基,混淆均匀,转移到细胞培养皿或培养瓶中,置于细胞培养箱中培养 。
?注意事项
1. 冻存历程中,在将冻存液加入到细胞之后,请尽量在冰袋四周操作,因为低温可以制止�；ぜ炼韵赴斐伤鹕� 。
2. 请包管细胞冻存管完全密封,制止在苏醒历程中冻存管炸裂 。
3. 理论上,本产品适用于种种哺乳动物细胞的冻存,但因细胞系种类繁多,无法逐一验证,因此我们推荐您在第一次使用本产品之前,事先对所冻存的细胞进行至少为期1周的试验性细胞 冻存苏醒培养,确认性能后再进行正式冻存 。
4. 本产品为无菌包装,无需过滤,请注意无菌取用 。
5. 为了您的宁静和健康, 操作时请衣着实验服并佩戴一次性手套 。
